微生物產幾丁質酶的研究概況及其應用

摘 要：本文就產生幾丁質酶的微生物種類、生態分布，微生物幾丁質酶的類型、酶學性質、作用機理及應用等方面的研究狀況進行了綜述。並且認為幾丁質酶系的研究與開發在農業、工業、食品、醫藥等領域展現出良好前景。


關鍵詞：微生物；幾丁質酶；應用

幾丁質（chitin）又稱甲殼素或甲殼質，是真菌、甲殼類動物、昆蟲、藻類等的重要結構物質，也是昆蟲腸圍食膜的重要成分，在自然界中儲量僅次於纖維素，是第二大天然多糖［1］。它是通過β-1，4糖苷鍵將N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，ANG）單元連接起來的長的直鏈聚合物，且有多種結構類型。細菌和真菌所分泌的幾丁質酶（chitinase）可將β-1，4糖甘鍵水解，最終產物為N-乙酰-β-D-葡萄糖胺。幾丁質也可經脫乙酰作用形成脫乙酰幾丁質（Chitosan，或稱聚葡萄糖胺），脫乙酰幾丁質又可進一步被脫乙酰幾丁質酶（Chitosanase）分解成氨基葡萄糖［2］。研究和利用幾丁質酶（chitinase）降解幾丁質從而進行病蟲害防治、醫藥生產、飼料加工一直是人們關註的課題。

1 微生物產幾丁質酶的研究概況

1905年，Beneck［3］首次分離到能夠利用幾丁質作為營養物質的微生物，定名為Bacillus chitinovirous（溶幾丁質芽孢桿菌），但當時沒有關於幾丁質酶活性方面的直接證據。1921年，Folpmers［3］發現分解幾丁質的細菌和放線菌在含幾丁質的瓊脂上形成透明圈，從而證明這些微生物內有水溶性的幾丁質酶存在。此後，人們又相繼從多種微生物（包括細菌、放線菌、真菌），多種植物及動物中分離到幾丁質酶，並對幾丁質酶的理化特性及生物學活性進行了大量的研究。目前，利用幾丁質酶對真菌生長進行抑制成為研究熱點，期望能將幾丁質酶應用於生物防治，並進一步通過基因工程手段培育出抗真菌的轉基因植物。

1.1 產幾丁質酶的微生物種類［4］

（1）細菌：粘質沙雷氏菌，環狀芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，斯氏假單孢菌，巨大芽孢桿菌，液化沙雷氏菌，液化腸桿菌，嗜水氣單孢菌等等。


（2）放線菌：灰色鏈黴菌，紅色鏈黴菌及其它一些未定種的鏈黴菌。


（3）真菌：溜曲黴，球孢白僵菌，米曲黴和木黴等。

1.2 產幾丁質酶微生物的生態分布［5］

產幾丁質酶的微生物分布廣泛，細菌中G+和G-菌中許多都能產生幾丁質酶。海洋、河灣、土壤中分布大量幾丁質酶產生菌，一些海灘、海水、鹽堿地、鹽場、溫泉是堿性幾丁質酶產生菌的理想場所。如產堿性幾丁質酶的菌株S.griseo fuscus S1001，就是從鹽場中分離出來的。

1.3 微生物產幾丁質酶的類型

按反應初級產物類型可分為內切幾丁質酶和外切幾丁質酶［6］。根據氨基酸序列的同源性，可將幾丁質酶分成18家族和19家族兩大類；按最適作用pH，可分為酸性、中性和堿性幾丁質酶。


1.4 酶學性質

微生物產幾丁質酶的分子量一般在19～110kD之間，不過有的可達到134759kD［2］，大多數微生物的幾丁質酶作用最適pH值在4～6之間，酶穩定的pH範圍一般在4～11之間，等電點一般在pH3.6～8.6之間，作用的最適溫度多為50～60℃，溫度過高，酶活力容易喪失。金屬離子如Ag+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Sn2+等對幾丁質酶活力都有不同程度的影響，有的離子能增強酶活性而有的卻具有抑制作用。幾丁質酶對底物具有一定的專一性，一般只可水解粉狀幾丁質、膠狀幾丁質、可溶性幾丁質衍生物如乙二醇幾丁質和二乙醇幾丁，及可溶性的幾丁三糖、四糖、戊糖和六糖等幾丁質寡糖；不能水解麥芽糖、澱粉和纖維素等由幾丁二糖經糖苷鍵連接而成的糖類。有的微生物如棉花黃萎病菌、金龜子綠僵菌和粘質沙雷氏桿菌產生的幾丁質酶還能水解脫乙酰幾丁質。

有些微生物在沒有誘導物的情況下產生幾丁質酶，但多數微生物只在含有幾丁質等誘導物的培養基中才能產生幾丁質酶［7］。幾丁質酶基因的表達是受受體/誘導物系統所控制，一般以幾丁質或其降解產物作為誘導物［8］。葡萄糖能抑制幾乎所有微生物產生幾丁質酶，說明幾丁質酶基因的調控可能涉及分解代謝物的阻遏機制。

微生物所產的幾丁質酶多是分泌型的，即在誘導物存在的條件下，微生物可以產生並向胞外分泌幾丁質酶。該酶先在微生物的體外將幾丁質分解，生成幾丁單糖（NAG）或寡糖，這些糖再被微生物吸收和利用［9，10］。

1.5 幾丁質酶作用機理

根據作用的部位，幾丁質酶主要以內切和外切的形式作用於底物。內切是對幾丁質糖鏈的任一部位進行隨機水解，產生包括二糖在內的幾丁質寡糖。外切是從多糖鏈的非還原性末端依次切下幾丁質二糖（也有人認為是單糖）。紙層析分析表明，微生物的幾丁質酶水解幾丁質的產物絕大多數是二糖，屬外切酶類，但也有報道皺鏈黴菌（Splicatus）的幾丁質酶屬於內切酶［11，12］。

2 微生物產幾丁質酶的應用

2.1 幾丁質酶降解產物的應用

幾丁質酶降解幾丁質，轉化、產生菌體蛋白和氨基寡糖素等產物，在人類食品、醫藥、化妝及動物飼料等行業廣泛應用［13］。此外，產幾丁質酶微生物可用於對有殼水生動物廢物的生物轉換，因而可起到保護環境的作用。

2.2 在生物防治中的應用

幾丁質是昆蟲表皮和腸圍食膜等幾丁蛋白復合體的主要結構成分，同時還是真菌（除卵菌外）和一些藻類細胞壁的整合成分，但植物和脊椎動物中不存在。大多數幾丁質酶生產菌對真菌具有拮抗作用，而且多數幾丁質酶在離體情況下也能抑制真菌的生長。因此人們把幾丁質酶看作是一個安全和具有較強選擇性的殺蟲劑靶標，這在幾丁質酶的應用中有著重要的意義，同時人們開始進行將幾丁質酶應用於生物防治的研究。

2.2.1 用於植物病原真菌的生物防治

產幾丁質酶的微生物能有效防治引起糧食、蔬菜發生病害的植物病原真菌，因此逐漸受到人們的重視。目前，在病害防治中已取得了令人鼓舞的成果，如用木黴菌防治蔬菜病害。國外已有商品化的木黴制劑問世，如美國的Topshield（哈茨木黴T 22）和以色列的Trichodex（哈茨木黴T39）［14，15］。

2.2.2 用於抗病基因工程

進入20世紀80年代，隨著分子生物學的蓬勃發展，使幾丁質酶用於生物防治的研究上升到基因工程水平。1984年Shapira［2］把幾丁質酶基因從粘質沙雷氏菌（S.marcescens）克隆到E.coli後，被整合的E.coli和酶的提取液，在室溫條件下均表現出對真菌的生物防治能力。1988年PhilliosW.等［8］將皺褶鏈黴菌（S.plicatus）的幾丁質酶結構基因以pBR 322為載體轉入到E.coli中，獲得了成功的表達。繼而，科學工作者采用植物基因工程技術，將幾丁質酶在生物防治中的應用又向前推進了一步。1990年英國科學家通過土壤農桿菌將細菌的幾丁質酶基因導入雙子葉植物中，成功培育出表達該酶的轉基因植物，此類植物可抑制病原真菌的侵襲，並對植物線蟲、昆蟲和其它一些病原生物也具有抗性。目前，通過此基因工程技術已獲得的轉基因植物有煙草、大豆、棉花、水稻和玉米。

2.3 在調節生命代謝活動中的應用

幾丁質被幾丁質酶降解後，可獲得具有生物活性的寡糖片段--氨基寡糖素。氨基寡糖素在調節植物細胞生命代謝活動中起著非常重要的作用。它作為植物功能調節劑，調控植物基因的關閉和開放，誘導植物分泌抗性酶，不但可以調節植物生長，還可增強植物對病原真菌的抗性。在動物腸道中，氨基寡糖素還可調節微生物的代謝活動，改善腸道微生物種群分布，刺激有益於動物健康的微生物（如雙歧桿菌）的生長，作為人體的功能性保健食品具有重要的開發價值。

總之，隨著對微生物產幾丁質酶理論研究的不斷深入，幾丁質酶應用範圍的不斷拓展，幾丁質酶系統在農業、工業、食品乃至藥物中的應用，必將發揮越來越重要的作用。◇